Nature竟然在同一天刊登两篇相似论文！国内外两个团队同时发现一种前所未见的自身炎症性疾病，且发病机制与近期这个热点蛋白有关

北京时间2019年12月12日，nature同时刊登了两篇极其相似的论文。其中一篇是由浙江大学生命科学研究院周青课题组与哈佛大学医学院袁钧英课题组、复旦大学附属儿科医院王晓川课题组等发表的题目为“A dominant autoinflammatory disease caused by non-cleavable variants of RIPK1”的研究性论文，作者发现了RIPK1变异会导致一种新型自身炎症性疾病并揭示了发病的分子机制。

就在同一天，澳大利亚WEHI医学研究所、美国NIH国家人类基因组研究所等处的研究人员也在nature报道了同一种疾病，他们将其命名为“CRIA综合征（cleavage-resistant RIPK1-induced autoinflammatory）”，同样揭示了该疾病是由RIPK1的关键细胞死亡成分突变引起的。研究论文为“Mutations that prevent caspase cleavage of RIPK1 cause autoinflammatory disease”。这两篇论文用相似的研究方法都证明了caspase-8介导的RIPK1裂解在胚胎发育中的重要性。（caspase-8是近期比较火的一个热点蛋白，详情可戳推文：三篇Nature齐发，再不了解这个热点你就out了）由于笔者是先发现的第二篇论文，看完了才发现与之相似的第一篇，今天就主要给大家介绍一下第二篇（无关崇洋媚外哈，勿喷）。

研究背景：RIPK1是先天免疫信号通路的关键调控因子。RIPK1的激活可促进多种细胞死亡反应，包括细胞凋亡和坏死性凋亡。为了确保最佳的免疫反应，RIPK1在翻译后由泛素化、磷酸化以及caspase-8介导的裂解精确调控，后者被认为能抑制RIPK3的激活和坏死性凋亡的发生，然而其真正的生理作用仍不清楚。人体中caspase-8 剪切RIPK1的位置是Asp324，小鼠中是Asp325。

研究人员发现了三个家族的患者，这些患者具有发作性高烧和淋巴结肿大、疼痛的病史，甚至伴随严重的发冷、头痛或幻觉的发生，从儿童早期开始并持续整个成年期。即使在无症状时，有些患者体内的炎症标记物表达也都明显升高，这些症状都是典型的自身炎症性疾病的表型。外显子测序显示来自这三个家族的受影响个体在caspase-8介导的RIPK1裂解所需的关键天冬氨酸残基（Asp，D）上具有不同的杂合错义突变。部分成员血清中促炎性细胞因子如TNF、IL-6等明显增多，转录组学分析显示该成员表现出一些丰富的炎症基因特征。使用IL-6受体拮抗剂可在部分成员显著改善症状。研究者们于是将这种疾病命名为“抗RIPK1剪切导致的自身炎症性综合征”（cleavage-resistant RIPK1-induced autoinflammatory(CRIA) syndrome ）。

为了研究CRIA综合征的分子机制，并对RIPK1在体内的裂解作用进行表征，研究者们培养出了天冬氨酸突变为丙氨酸（D→A）的转基因小鼠，结果发现纯合子Ripk1^D325A/D325A小鼠在胚胎形成中期就会死亡，几个身体部位会有轻度到重度出血，心内膜及视网膜等发育不全，四肢较小。免疫染色显示卵黄囊内大量细胞死亡。这些症状与敲除casp8（casp8^-/-）缺乏TNF信号通路的小鼠表现类似，先前已有研究证明casp8^-/-小鼠中胚胎致死是TNF依赖的，敲除Ripk3或mlkl可阻止这一过程。实验结果证明RIPK3的缺失比MLKL更能延长Ripk1^D325A/D325A小鼠的存活时间，这表明RIPK3在早期胚胎致死率中对于坏死性凋亡起保护作用。Casp8和Ripk3的联合缺失阻止了胚胎的致命性。有趣的是，对RIPK1激酶活性的抑制可挽救Ripk1^D325A/D325A小鼠的胚胎致死率（下图d）。这些结果都表明在胚胎发生过程中，caspase-8无法裂解RIPK1可导致细胞的坏死性凋亡。

为了探讨RIPK1在细胞凋亡和坏死性凋亡重要信号——TNF信号转导中的功能，研究者们测试了纯合子Ripk1^D325A/D325A小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)对TNF诱导的细胞死亡的响应。结果发现与野生型MEFs相比，Ripk1^D325A/D325A MEFs对TNF诱导的细胞死亡高度敏感，同时伴随着RIPK1磷酸化的增加和caspase-8的激活。敲除RIPK3或抑制RIPK1激酶活性都可以减少TNF导致的坏死性凋亡。值得注意的是，敲除RIPK3不仅可以完全逆转细胞死亡，还能阻断RIPK1的磷酸化和caspase-8的激活。这些结果暗示了RIPK3参与了Ripk1^D325A细胞中caspase-8的激活。在敲除RIPK3之后，不论RIPK1激酶是否具有活性，caspase-8都是处于非激活状态（下图b右侧两部分），证明RIPK3参与Ripk1^D325A细胞中caspase-8的激活不主要依赖于RIPK1激酶活性。

患有CRIA综合征的病人通常会伴有复发性的发热，因此为了了解RIPK1裂解的缺失如何影响机体对炎症刺激的反应，研究者们测试了Ripk1^D325A/+小鼠（纯合致死，这里用了杂合小鼠）对toll样受体(TLR)配体的反应。在LPS或poly(I:C)刺激后，尽管IL-6没有显著变化，TNF和IL-1β的含量显著增加。患者PBMCs（外周血单核细胞）也是类似反应，BMDMs（骨髓来源的巨噬细胞）则产生更多的TNF。与对照组相比，移植Ripk1^D325A/+造血细胞的野生型小鼠和移植Ripk1^D325A/+骨髓的野生型小鼠都对LPS的反应都很敏感。caspase-8和Ripk3的联合敲除逆转了TNF和IL-1β的增长（下图e），可见在Ripk1^D325A/+检测到的细胞因子的增加是RIPK3和caspase-8依赖的，结果表明细胞死亡是细胞因子产生的主要原因。

总结这篇文章，作者发现了RIPK1在caspase裂解位置的杂合错义突变可导致CRIA综合征，Ripk1^D325A/D325A小鼠在胚胎形成期间就会死亡，共同敲除Casp8和Ripk3才能阻断。Ripk1^D325A/D325A和Ripk1^D325A/+细胞对于RIPK3依赖的TNF诱导的细胞凋亡和坏死性凋亡很敏感，Ripk1^D325A/+小鼠虽然能存活，但对于炎症刺激也很敏感。本篇研究证明了caspase介导的RIPK1裂解在胚胎发育中的重要性，并表明RIPK1的caspase裂解不仅能抑制细胞的坏死性凋亡，还能在整个生命过程中维持炎症内稳态。

再简单介绍一下周青教授的研究，在两个家庭中通过外显子测序发现了RIPK1在D324位点突变会导致自身炎症性疾病，并在病人PBMCs中发现了显著上调的IL6, TNF, IL10等炎症因子或趋化因子，进而发现不可剪切的RIPK1可导致RIPK1激酶活性的增加，从而引起细胞坏死，抑制RIPK1可缓解这一过程。相反的是，成纤维细胞表现出对TNF或LPS诱导的细胞死亡的抵抗，同时细胞内RIPK1、MLKL磷酸化减少，RIPK1、TNFR1等蛋白表达水平降低，抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）含量增加，活性氧（ROS）下调。全文证明了RIPK1的抗剪切突变可导致细胞凋亡及炎症的发生。两篇文章互相补充，较为全面地解释了由RIPK1导致的自身炎症性疾病的发病机制，也为其他炎症性疾病提供了参考。

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